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原始cellpress cell press细胞科学被列入话题的#cell press新冠资源中心70生命科学life science年1月31日，cell press新型冠状病毒资源中心正式开业 covid-19相关论文的投稿策略和cell press期刊上关于疫情和病毒的论文可以在此资源中心的页面上查看。 网站正在不断更新，所有复印件都可以免费阅览。 刊登在cell press细胞出版社期刊cell上的最新研究被称为“functional SARS-cov-2-specificimmunememorypersistsaftermildcovid-19”华盛顿大学 对轻度covid-19康复患者进行纵向判断，明确他们是否产生和维持多方面的sars-cov-2特异性免疫记忆，持续存在轻度covid-19诱导记忆淋巴细胞，抗病毒免疫的功能特点 这为疫苗的开发和防御周期提供了非常有利的佐证 cell press细胞出版社微信公众平台解读这篇论文，为了与广大科学研究者深入分享这一研究成果和一点未来展望，目的是点击“阅读原文”，或识别下图的二维码阅读英语原文 *以下部分副本是从英语翻译的。 仅供参考。 请根据英语的原文 用长图像识别二维码浏览原文摘要: sars-cov-2病毒在全球范围内引起大流行，病例数持续上升 很多感染者经历过轻度症状的冠状病毒病( covid-19 )，但这是否会诱发持续的免疫记忆，对免疫有帮助还不清楚 我们对轻度covid-19康复患者进行了纵向判断，明确了他们是否产生和维持了多阶段的sars-cov-2特异性免疫记忆 康复患者至少产生3个月的sars-cov-2特异性igg抗体，中和了血浆、记忆b细胞和记忆t细胞 我们的研究数据还表明sars-cov-2特异性igg记忆b细胞随着时间的推移而增加 另外，sars-cov-2特异性存储淋巴细胞显示出与强抗病毒功能相关的特征:存储t细胞分泌细胞因子再次与抗原接触时增加，存储b细胞受体表达为单克隆抗体时可以中和病毒 因此，轻度covid-19诱导记忆淋巴细胞持续存在，表现出抗病毒免疫的功能特征 为了明确轻度症状covid-19后是否形成免疫记忆细胞，收集了15例轻型covid-19(cov2+)(uw irb 00009810 )康复患者的血浆和外周血单核细胞( pbmcs ) cov2+样品的平均年龄为47岁，报告的轻度症状持续时间的中位数为13天(表1 )。 第一次采血( visit 1)在sars-cov-2核酸检测阳性至少20天后，症状出现后35.5天(中位数) 随着病毒量在症状出现后8天左右被除去，这时的第一反应是感染，预计会产生记忆细胞群( wölfel等人)。 参加者平均在症状出现后86天后再次采血( visit 2)，可以判断持续记忆细胞群的数量和质量(图1a )。 将这些样品与17名健康对照组( hcs )在2个时间点采集的样品进行比较，采样时间间隔类似 所有hcs均未检测出血浆sars-cov-2 rbd特异性抗体或s-特异性抗体，高于年前提取的历史阴性( hn )血浆样品平均值的3个标准偏差( sds )。 这是因为所有的hcs以前都没有感染sars-cov-2 (图s1 )。 在对sars-cov-2感染的第一个反应期间，被激活的固有免疫细胞和适应性免疫细胞在血液中大量生长( mathew等)。 急性病毒感染被除去后，这些高度炎症性的细胞的大部分死亡，或者成为静止的记忆细胞，因此无法区分整体的免疫细胞的比例和表型和感染前的血液试样 与一次反应的结果一致，发现cov2+和hc个人之间pbmcs的总单核细胞、单核细胞亚群或浆细胞样树突状细胞的数量没有差异(图s2 )。 还发现γδ和αβ cd3+ t细胞频率( cd4+和cd8+ )、细胞周期状态、各种cd45ra-记忆性t细胞亚群的活化、移动、功能和比例相关分子的表达没有差异(图s3a-h )。 还发现cd19+ b细胞的比例没有差异(图s3i )。 如上所述，这些数据显示，与急性感染相关的炎症反应在visit 1时刻被消除，早期免疫记忆阶段开始了 轻度covid-19诱导持续中和抗sars-cov-2 igg抗体的体液免疫反应的优点是第一波暂时产生由低亲和力抗体分泌的pbs，然后继续生发中心( gc )反应，产生高亲和力mbcs和抗体分泌llpcs 根据具体病毒感染情况，llpcs可以维持几个月到几年的血浆抗体滴度( slifka和ahmed，1996 ) pbs形成于急性sars-cov-2感染期间，但症状出现后约1个月，康复患者中就不存在pbs了( Mathew等人) 这可能包括visit 1测定的抗体中已经不存在的大量短寿命pbs，根据抗体半衰期的计算(约23天) ( cohen和freeman，1960 )，visit 2中出现的来自pb的抗体的6% 因此，在visit 2的情况下，llpcs可能对大部分抗体有贡献，维持血液中rbd特异性抗体的水平 因此，测定了visit 1和visit 2中血浆中sars-cov-2特异性igg、igm、iga抗体水平( ma等) 在visit 1中，所有cov2+患者的血浆抗rbd igg水平比hcs平均值高3标准偏差，这是用elisa曲线下面积( auc )测定的，与第13天血清阳性率100%的研究一致( long等人，。 另外，很多cov2+患者的visit 1次抗rbd-igm和抗rbd-iga抗体高于阴性阈值，同时igg、igm、iga的抗S抗体也高于该阈值(图s4a )。 全部同型抗rbd和抗s结合水平高度相关(图s4b ) 在visit 2中，所有的cov2+个人的抗rbd igg水平都保持在阴性阈值以上，但保持抗rbd igm和iga的cov2+个人很少(图1b )。 两个时间点之间cov2+个人抗rbd igg水平略有下降，提示igg抗体水平因抗体分泌llpcs的形成而稳定 但是，从visit 1到visit 2，抗rbd igm和iga显着下降，表明早期pbs的表达没有被LPC维持(图1c )。 spike蛋白，特别是rbd是病毒进入细胞的关键，因此对rbd的抗体可以成为感染的比较有效的抑制剂( robbiani等； shi等人) 为了明确cov2+个人是否形成和维持中和抗体，使用抑制rbd-ace2结合的无细胞分解(替代病毒中和试验，svnt )间接地检测sars-cov-2中和作用，斑块减少中和试验( prnt ) cov2+血浆抑制rbd和ace2的结合明显高于hc血浆，rbd抑制与2时抗rbd igg水平密切相关(图1d和1e )。 另外，从visit 1到visit 2，cov2+血浆rbd的抑制能力是一定的(图1f )。 prnt的中和作用两个时刻都与rbd抑制密切相关(图1g )，同时在两次随访之间维持着类似的中和作用(图1h )。 2时，许多cov2+血浆通过prnt在1:160稀释度下表现出至少50%的中和作用 直到我们研究的最新时刻，许多cov2+个人的rbd抑制血浆和中和血浆优于hcs 这些数据与igg+ rbd特异性llpcs的出现一致，这些llpcs在症状出现后至少3个月内可以检测到中和抗sars-cov-2抗体 轻度covid-19诱导的rbd特异性igg+记忆B细胞在持续积累cov2+患者症状3个月后出现的sars-cov-2中和抗体表明形成了来自gc的llpcs gcs也产生持续的mbcs，在抗原再暴露后产生分泌pbs的高亲和力抗体方面起着重要的作用 因此，我们在整个研究过程中测试了cov2+个人是否形成和维持了sars-cov-2特异性的mbcs 我们生成了rbd四聚体试剂，用富集战略识别了表型检测不到的rbd特异性B细胞( krishnamurty等人)。 我们用rbd免疫小鼠测定了我们试剂的特异性( walls等人，)，并用它识别、计数和表型了来自hc和cov2+个人的pbmc中罕见的rbd特异性B细胞。 用于表型rbd特异性b细胞的期限由b细胞总数定义(图s5a )。 visit 1的情况下，与hcs相比，cov2+个人的rbd特异性b细胞增多，从visit 1到visit 2，cov2+个人的rbd特异性b细胞数明显增加(图2a和2b )。 正如预料的那样，在hc和cov2+个人血液中发现了极少数的cd20- cd38+ rbd特异性抗体分泌细胞( pbs和pcs ) 这支持llpc (可能在骨髓中)在visit 2时产生大部分rbd特异性抗体的观点(图2c )。 cd21和cd27的表达区分cd21+ cd27-幼稚b细胞、cd21+ cd27+经典mbc和cd21- cd27+/-激活的MBCS ( Weisel和shlomchik，) 在cov2+个人中，大部分rbd特异性B细胞为cd21+ cd27+经典mbcs，hc个人中rbd特异性B细胞大多为幼稚B细胞(图2d和2e )。 cov2+样品中rbd特异性mbc的数量平均高于hcs，同时在visit 2中进一步增加(图2f )。 b细胞受体( bcr )从igm和igd变化为igg、iga或ige，与形成高亲和力中和抗体所需的bcr亲和性成熟有关( weisel和shlomchik，)。 cov2+rbd特异性mbcs富含igg+ mbcs，少数hc rbd特异性mbcs为未转移( igm+和igd+ ) (图2g、2h和s5b ) 最引人注目的是，在visit 1中，与hc个人相比，在cov2+个人中，igg+ rbd特异性mbc数的增加在visit 2中也进一步增强(图2i )。 比较少的cov2+rbd特异性mbc表达了iga，但在这两个时刻都明显高于hc个人(图s5b )。 抗病毒mbc功能的另一个测定指标是t-bet的表达( knox等人，A )。 表达t-bet的mbc参与二次感染期间产生显示高亲和性的病毒特异性抗体的二次pbs的迅速分化( knox等人、B ) 在visit 1中，可知cov2+患者t-bet+ rbd特异性mbc的数量平均高于hcs，在visit 2中维持了较高的数量(图2j )。 这些数据表明，igg+ rbd特异性古典mbcs不仅通过轻度covid-19的反应形成持续存在，而且其数量在症状出现后13个月持续增加 sars-cov-2感染诱导持续、功能性spike反应性记忆cd4+t细胞t依赖性igg+ rbd特异性mbcs的存在提示cov2+个人也有抗原特异性记忆T细胞应答 为了计算sars-cov-2特异性cd4+记忆性T细胞，将hc或cov2+个人的总pbmc与载体对照或spike蛋白一起培养，20小时后判定活性标记的表达(图3a)(bentebbel等人，RR 首先，关注含有icos和cd40l的特异性tb受体对成员的活化诱导表达 在visit 1和visit 2中，来自cov2+个人的cd4+t细胞被spike蛋白重新激活后，与载体对照组相比，icos和cd40l的表达增强(图3b )。 少数hc个人也发现了少量spike反应活化的cd4+t细胞，但平均来看，这些细胞在hc队列整体上没有明显增加 另外，在visit 1和visit 2之间，cov2+个人应答细胞的数量没有显着差异，提示在整个研究过程中维持着spike特异性记忆cd4+t细胞(图3b )。 另外，与hc患者相比，在cov2+患者的再刺激样品中多见表达cxcr5的循环性T滤泡辅助细胞( ctfh )细胞( vinuesa等)，同时两次采样之间不变(图3c )。 这些数据表明，sars-cov-2特异性记忆性cd4+t细胞维持在症状出现后3个月内，部分细胞可以提供b细胞的帮助 抗原特异性地增殖cd4+t细胞，再增殖记忆细胞群，抗原再暴露时产生效应细胞( sallusto等人，1999 ) 为了正式说明cov2+个人中spike特异性cd4+t细胞在再刺激前具有记忆表现型，测定了对spike再刺激反应的初步分类记忆和幼亚群的增殖能力 因此，筛选出来自hc或cov2+个人的cd45ra+幼小、cd45ra- ccr7+中央记忆( tcm )和cd45ra-ccr7-效应记忆( tem)t细胞 其次，测定细胞增殖的频率，因为培养56天后稀释了细胞增殖染料( cpd ) (图3d )。 还检测出了CCR6+ (与th17产生的th17细胞相关)和cxcr3+ (与IFNγ产生的th1细胞相关)的表达。 因为th1和th17亚群与保护其他呼吸道病毒感染有关( sallusto，。 cov2+个人经过5天的培养，从筛选出的幼稚细胞中出现少量增殖( cpdlo)cxcr3+ cd4+ th1细胞，由于hc个人没有发现，因此有可能代表被污染的记忆细胞(图3e )。 与hc样品相比，所有cov2+个人筛选的tcm细胞显示出明显高的cxcr3+ cpdlo t细胞比例，这些T细胞随spike增殖 一点cov2+个人在tem细胞中发现了很多增殖反应，但在cov2+组中发现了更大的变化 这些数据表明，从轻度covid-19恢复的个人中，持续存在表达spike特异性tcm的cxcr3和表达少许tem的cxcr3，在再次遭遇抗原时有增殖、增殖分化记忆细胞的能力 为了参与、补充和激活固有细胞和其他适应性淋巴细胞，记忆t细胞迅速表达多个细胞因子 其次，为了更好地理解sars-cov-2特异性记忆细胞的功能，详细分析了cov2+和hc患者visit 2时持续存在的spike反应性记忆t细胞的细胞因子谱 cd4+ cxcr5+记忆性tfh细胞产生的特异性细胞因子影响B细胞的活化和分类转化，cd4+ cxcr5- t效应细胞表达高水平的细胞因子，参与抗病毒治疗 我们调查了各种辅助性t细胞亚群产生的细胞因子( ifn-γ、il-2、il-4、il-17 )，用pma/离子霉素激活的cd69+细胞确认了染色(图s6b所示的代表图) 由于ccr6和cxcr5的表达，活化的cd69+ cd4+记忆细胞进一步成为亚群。 因为在sars-cov2感染后的早期，最近记述了spike特异性ccr6+ cxcr5+ ctfh的主要群(图s6c )。 spike再刺激后，cov2+样品与对照组相比显示了大量被激活的细胞因子产生细胞，而hc样品显示了少量被激活的细胞因子产生细胞(图3f )。 cov2+样品中细胞因子的产生主要受il2和ifn-γ的表达控制，il-17a的产生频率低，未发现明显的il4产生(图3g和s6d )。 spike反应性ccr6亚群表达il2和ifn-γ的频率高于ccr6+细胞，但少数il-17生产者如预期那样表达ccr6 如上所述，这些数据表明，功能性spike特异性记忆cxcr5+ ctfh和cxcr5- teff细胞在症状出现后持续3个月，这些细胞主要产生th1细胞因子，少量存在产生il-17a的细胞群 最近的研究聚焦于抗体和b细胞，而记忆cd8+t细胞也有自己的功能，通过直接表达细胞因子和细胞溶解分子，可以杀死感染病毒的细胞 因此，我们用与上述相同的细胞因子活化试验和样品探讨了是否存在功能性cd8+记忆t细胞 covid-19轻症后持续3个月的spike特异性记忆cd8+t细胞可以通过在培养sars-cov-2 spike和20小时后表达活化标志物cd69和细胞因子ifn-γ来识别(图3h )。 但是，与cd4+记忆t细胞不同，在hc和cov2+组表达的cd8+t细胞的活化细胞因子数显着增加(图3i )。 这些数据表明，轻度症状的covid-19人在症状发作3个月后再次刺激，th1 cd4+ sars-cov-2特异性ctfh和非tfh记忆t细胞可以维持和产生效果细胞因子 这些数据进一步表明，健康对照组中大量存在ifn-γ、产生交叉反应性的cd8+t细胞 sars-cov-2特异性MBS可表达中和抗体，sars-cov-2 rbd特异性mbc和S特异性cd4+ ctfh个月后在cov2+个人中变得丰富，因此我想知道这些mbc在二次感染后是否有可能产生中和抗体 因此，我们对单一的rbd特异性B细胞进行了索引筛选，在2个时刻测序了来自3个cov2+个人的bcrs (图s7a和4a )。 我们测序了所有的igg+ rbd特异性经典mbcs(cd21+ cd27+ )，克隆了成对的重链和轻链序列，表达为igg1单克隆抗体 含有来自visit 1抗体共计19个，来自visit 2的抗体共计16个 这些抗体首先为了筛选而在小规模培养基中表达 igg elisa (图s7b和s7d )判定转染上清液的抗体表达，通过rbd elisa检测特异性，但在各时刻除1抗体外，所有抗体都与rbd具有强结合性(图4b和4d )。 然后在svnt试验中判断抗体抑制rbd和ace2受体结合的能力 在visit 1中，从受试者克隆的18个抗体中有8个( 44% )可以抑制rbd和ace2的结合，在visit 2中，15个受试者中有7个( 47% ) (图4c和4e )。 visit 1中，2种抗体显示出较低的抑制水平，但其他抗体的抑制水平与强中和阿尔帕纳米体类似( hanke等人) 然后，这些抗体更大规模地表达、纯化，进行更详细的分解 纯化抗体再次用elisa验证了rbd的特异性(图s7c和s7e )，用prnt试验检测了所有visit 2抑制剂、大部分visit 1抑制剂和一些非抑制剂的sars-cov-2中和能力。 所有的抑制抗体都强烈中和病毒，ic50值在7.15到49.61ng/ml之间(图4f和4g )。 这相当于之前发表的作为阳性对照( ic50=3.6 ng/ml )的强中和小鼠抗体(2b04 ) ( Also USSI等人，年) 其中2种非抑制性抗体( #205和#211 )如与非中和小鼠抗体( 2c02 )无关的疟疾原虫特异性人抗体( msp-003 )那样，不能如预期那样抑制病毒感染 有趣的是，另外两个测试的非抑制性抗体( #203和#207 )可以中和活病毒，其中#203的ic50相当于强抑制剂( 15.4 ng/ml )，在svnt测试中可以中和活病毒的单克隆rbd特异性抗体 50%以上的被检抗体通过任意一种或两种方法显示出活性 该抗体采用多种重链和轻链，都经历过体细胞的超变异( shm )，同时是唯一的克隆(表2和s1 )。 visit 1和visit 2之间，重链和轻链的shm水平平均上升，但这些差异没有统计学意义(图s7f和s7g )。 因此，由sars-cov-2感染引起的rbd特异性mbcs产生多个中和抗体，有助于第二次接触时的保护 康复个人形成多方面的sars-cov-2特异性免疫记忆，在对麻疹、甲型肝炎等人类病毒感染的应答中，病毒特异性igg+抗体、igg+ mbcs、cd4+记忆T细胞、cd8+记忆T细胞 plotkin，) 免疫记忆的成分第二次暴露在sars-cov-2中足以受到保护，但这些成分应该发挥协同作用形成多层防御 为了明确我们队列的cov2+个人是否形成和维持多个免疫记忆成分，我们对每个人进行了sars-cov-2特异的功能性免疫记忆成分的判断。 这些成分在visit 2时在cov2+个人方面有显着差异，因此可能会影响对第二次接触的保护作用。 hcs和cov2+个人按感染状态分组，visit 2时免疫记忆的独立指标值在heatmap图中有报告(图5 )。 由于不知道这些测量标准的保护阈值是多少，因此将比各测量标准(行)的hcs值的平均值高的标准偏差设定为阈值(灰度为白色)。 由此可知，cov2++个人的反应比hcs检测到的高 我们序列的14名cov2+个人是visit 2时形成和维持免疫记忆的多种成分，水平比hcs高 除一例cov2+个人( cov2+ 8)外，所有cov2+个人的rbd特异性igg+抗体效价均高于hcs，rbd-ace2结合的血浆抑制作用增强，同时rbd特异性igg+ mbcs的数量高于S 许多cov2+个人( 11/14 )也维持了比hcs更高数目的迅速表现效果的细胞因子( il-2、ifn-γ和/或il-17a )的刺激性cd4+记忆t细胞 与hcs相比，少数cov2+个人(5/14 )的spike反应性也越来越多，具有产生ifn-γ的cd8+记忆t细胞 这些数据表明，我们序列中的所有cov2+个人都形成和维持了多种功能性、适应性免疫记忆成分 相关论文新闻原文是刊登在cellpress细胞出版社旗下的期刊cell上的“阅读原文”或扫描下面的二维码看论文∈论文标题: functional SARS-cov-2-specificimune mm full text/s 0092-8674 ( 20 ) 31565-8㎜doi:doi/10.1016/j.cell.11.029长图像识别二维码阅读原文中文审查: cell科学杨扬cell press新型冠状病毒资源中心年1月 covid-19论文的投稿策略和cell press期刊上关于疫情和病毒的论文可以在此资源中心的页面上查看。 网站正在不断更新，所有复印件都可以免费阅览→ 原标题:“轻度covid-19后体内新型冠状病毒免疫记忆持续| 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